酶ELISA試劑盒，即酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒，是酶免疫測定技術(shù)中應(yīng)用廣的技術(shù)。其基本原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價結(jié)合，這種結(jié)合既不會改變抗體的免疫學(xué)特性，也不影響酶的生物學(xué)活性。酶標(biāo)記抗體可以與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。在加入底物溶液后，底物在酶的作用下會使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色的氧化型，從而出現(xiàn)顏色反應(yīng)。因此，可以通過底物的顏色反應(yīng)來判定有無相應(yīng)的免疫反應(yīng)，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比。
酶ELISA試劑盒在使用前的準(zhǔn)備是確保實驗準(zhǔn)確性和可重復(fù)性的關(guān)鍵步驟。以下是系統(tǒng)化的準(zhǔn)備流程及注意事項：
一、試劑與材料準(zhǔn)備
試劑平衡與分裝
溫度平衡：
未開封的試劑盒需提前從冰箱（2-8℃）或冷凍（-20℃）中取出，室溫（20-25℃）平衡30分鐘，避免溫差導(dǎo)致冷凝水稀釋試劑。
分裝處理：
若試劑需多次使用，建議分裝成單次用量（如標(biāo)準(zhǔn)品、酶標(biāo)抗體），避免反復(fù)凍融導(dǎo)致失活。
試劑檢查
外觀確認(rèn)：檢查液體試劑是否渾濁、沉淀或變色（如TMB底物變藍(lán)可能已氧化失效）。
有效期驗證：確保試劑在保質(zhì)期內(nèi)，開封后未過期（如部分試劑開封后穩(wěn)定性僅1個月）。
標(biāo)準(zhǔn)品配制
梯度稀釋：根據(jù)說明書用樣本稀釋液（如PBS或?qū)Ｓ镁彌_液）將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成系列濃度（如1:2遞進稀釋），用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
混勻操作：使用渦旋儀輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，影響準(zhǔn)確性。
二、實驗器材準(zhǔn)備
耗材預(yù)處理
酶標(biāo)板：
檢查板條是否變形或受潮，開封后未使用的板條需密封并加干燥劑保存。
如需自備板條，選擇高結(jié)合力ELISA板（如平底96孔板），避免使用含去垢劑的板子。
吸頭與容器：使用無酶、無內(nèi)毒素的離心管及一次性吸頭，避免交叉污染。
儀器校準(zhǔn)
移液器校準(zhǔn)：確保移液精度（如使用0.1-10μL、20-200μL量程），定期校準(zhǔn)。
洗板機設(shè)置：調(diào)整洗板次數(shù)（通常5次）、浸泡時間（30秒）及吸液速度，避免殘留或沖掉結(jié)合抗體。
三、樣本處理
樣本采集與保存
血清/血漿：收集后盡快離心（3000 rpm，10分鐘），分裝后-20℃或-80℃凍存，避免反復(fù)凍融。
細(xì)胞上清：離心去除雜質(zhì)（如細(xì)胞碎片），直接用于檢測或暫存于2-8℃（24小時內(nèi)使用）。
樣本稀釋
用試劑盒提供的稀釋液（或PBS）將樣本稀釋至合適倍數(shù)，避免基質(zhì)效應(yīng)干擾（如血清稀釋10倍可減少非特異性結(jié)合）。
